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--- 神經系統-成像技術 ---

成像技術

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腦科學研究的關鍵是要實現對神經元集群活動的實時觀察，并通過特定神經環路的結構追蹤及其活動操縱，研究其對腦功能的充分性和必要性，進而在全腦尺度上解析神經環路的功能和結構。

鈣離子成像技術

鈣離子成像技術（Calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監測組織內鈣離子濃度的方法，常用于神經系統的研究，指示神經元內鈣離子的變化，提示神經元活動。其原理在于借助鈣離子濃度與神經元活動之間的嚴格對應關系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針（鈣離子指示劑，Calcium indicator），將神經元中鈣離子的濃度通過熒光強度表現出來，并被顯微鏡捕捉，從而達到監測神經元活動的目的。

因而，鈣離子成像技術的核心在于鈣離子指示劑，現在廣泛使用的鈣離子指示劑有化學性鈣離子指示劑（chemical indicators）和基因編碼鈣離子指示劑（genetically-encoded indicators）兩類：

　　1、化學性鈣離子指示劑：指的是可以螯合鈣離子的小分子，所有這些小分子都基于BAPTA（氨基苯乙烷四乙酸），BAPTA能夠特異性地和鈣離子螯合，而不會和鎂離子螯合，所以被廣泛地用作鈣離子螯合劑。目前較為成熟的化學性鈣離子指示劑包括Oregon Green-1、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4。　

　　2、基因編碼鈣離子指示劑：這些指示劑是來自于綠色熒光蛋白（GFP）及其變異體（例如循環排列GFP、YFP、CFP）的熒光蛋白質，與鈣調蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域融合。現在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有：GCaMP、Pericams、Cameleons、TN-XXL和Twitch，其中GCaMP6由于它有著超強的敏感度，現在被廣泛應用于活體鈣成像研究，其發出熒光的原理在于鈣離子濃度上升導致M13與CaM結合，從而改變cpEGFP的構象，將其從無熒光的狀態變為綠色熒光。

GCaMP蛋白的基本結構和原理（Jasper Akerboom, et al., Biol Chem,2009）

常見的可遺傳編碼鈣離子指示劑

鈣離子成像技術是一類可以在活體動物觀察神經元活動的技術，其突出優點在于能夠同時觀察一群細胞的活動，借助病毒載體的特異性表達能力和神經環路標記能力，我們還可以觀察特定類型細胞的活動。

電壓成像技術

神經元細胞膜上的電勢是大腦中重要的信息載體。因此，監測單個神經元的電壓動態，從突觸輸入到軸突輸出，對于理解行為背后的神經過程是至關重要的。

細胞的細胞膜上鑲嵌的各種轉運蛋白和跨膜離子通道可以控制Na+、K+等離子進出細胞。從而形成持續存在的跨膜離子濃度梯度，由此形成的胞內外的電位差異就是膜電位。當細胞接受外界刺激時，膜電位會發生變化，而電壓成像技術的基本原理就在于通過對電壓敏感的熒光指示劑 (Voltage Indicators) 直接標記膜電位變化，再借助熒光成像手段監測神經元電活動。

1、最初科學家們會借助傳統電壓敏感染料進行神經活動的動態研究，然而電壓敏感染料的光信號太弱，由膜電位變化引起的染料信號變化只有靜息時背景光強的萬分之一到百分之一，同時，化學染料對細胞選擇性差，無法做到特異性對不同類型的細胞進行觀察。此外，電壓敏感染料會導致細胞發生永久性的變化，甚至改變其光動力學性質，無法對活體動物進行長期觀察。

2、基因編碼的電壓指示劑（genetically encoded voltage indicators, GEVIs）：和電壓敏感染料相比，GEVIs 最大的優勢就是可以特異性地標記各種類型的神經元或亞細胞結構，實現高時空分辨率的成像工作。GEVIs 一般基于以下三種工作機制：

①膜電位發生變化時，細胞膜上鑲嵌的許多蛋白質分子都會改變形狀，這類隨膜電位改變形狀的蛋白分子叫電壓敏感元件。將電壓敏感元件與熒光蛋白或化學共價熒光標記蛋白相結合，形成一個嵌和蛋白，當細胞膜電壓發生改變時，電壓蛋白構象發生變化會干擾熒光蛋白發色團的化學環境，從而改變熒光亮度。

②基于視紫紅質等視蛋白（Opsin）的電壓敏感熒光探針，微生物視紫紅質的吸收和熒光都是電壓敏感的，且反應迅速，膜電位發生變化時，視蛋白通道構象發生改變，進而影響視蛋白的熒光發生變化。

③能夠感知電壓變化的FRET（熒光能量共振轉移, fluorescence resonance energy transfer, FRET）探針，將熒光蛋白融合到電壓敏感元件或視蛋白上，當細胞膜電位發生變化時，帶電荷的有機分子會在細胞膜中移動，從而導致相連的熒光蛋白產生熒光共振能量轉移效應，改變其熒光亮度。

三種類型GEVIs的示意圖

（Storace, D., et al., Trends Neurosci, 2016）

電壓成像病毒列表

神經元功能成像是探究神經元編碼各種功能的重要科學手段，目前最常用方法為鈣成像和電壓成像。然而，神經元鈣信號衰減很慢，不能充分表征動作電位與閾下電位。基因編碼的電壓指示劑（GEVIs）能夠以高空間和時間分辨率監測神經元的快速放電信號與閾下電活動，實時監測細胞膜電位的波動，相比于鈣指標，更能直接反映神經元的活性。

神經遞質探針

人腦大約有1010-1012個神經元，每個神經元擁有103-104個突觸與其他神經元形成聯系。神經遞質作為突觸間傳遞信息的重要“信使”，參與多種生理過程。神經遞質的正常釋放對于維持機體正常的生理功能發揮著重要作用,同時,神經遞質的釋放與調節出現異常時，也常常伴隨著神經退行性疾病、抑郁癥等疾病的發生發展。因此,在分子、細胞、環路等層面精確地分析檢測神經遞質是如何參與并調節上述生理和病理過程,能夠更深入地了解疾病的發病機制,并為臨床藥物的開發奠定基礎。

要更好地研究這些神經遞質在生理、病理過程中扮演的角色，研究人員需要實時檢測活體內特定腦區的神經遞質信號變化，看清它們的“一舉一動”。可遺傳編碼的神經遞質探針的成功開發可以實時精確的檢測內源神經遞質的動態變化，為研究大腦的復雜功能以及神經系統疾病機制的解析提供重要的工具。

由于該類探針具有可基因編碼的特性，研究者可以通過轉染、病毒注射以及構建轉基因動物等手段，將新型探針表達在細胞、小鼠腦片，以及活體果蠅、斑馬魚及小鼠中，并結合現有的成像技術，把“難以捉摸”的神經遞質變化情況變成了直觀、易測的熒光信號，做到在不影響細胞正常生理功能的情況下實時精確的檢測活體動物中內源神經遞質的動態變化。在此基礎上，科學家們還對探針進行了全方位的優化，，使具有極高的分子特異性和時空分辨率（時間上達到毫秒級，空間上即可測得特定腦區的整體觀，也可精確至單細胞）。

常見的可遺傳編碼的神經遞質探針

①GRAB神經遞質熒光探針：北京大學李毓龍教授團隊利用可與神經遞質相結合的G蛋白偶聯受體（GPCR）作為探針的骨架，成功開發出一系列新型可遺傳編碼的神經遞質熒光探針。其原理在于：在 GPCR 中存在一段配體（神經遞質）結合后構象改變最顯著的區域，將循環重排并對構象變化敏感的綠色熒光蛋白（cpEGFP）插入到該區域中，神經遞質與GPCR的結合會引起其構象的改變,而這種變化又引起cpEGFP發生構象的變化，進一步影響其發色團周圍的微環境,最終導致其熒光強度的改變。